Articoli Medicina Legale - P&R Scientific
Volume 2, Numero 4
23.11.2012
Quantificazione del DNA con real time PCR e risultati di amplificazione degli short tandem repeats (STRs)
 
 
Zoppis S, D’Alessio A, Rosini M, Vecchiotti C

Autori   [Indice]

 Zoppis S1, D’Alessio A2, Rosini M1, Vecchiotti C1

1Dipartimento di Scienze Anatomiche, Istologiche, Medico-Legali e dell’Apparato Locomotore, Laboratorio di Genetica Forense, “Sapienza”Università di Roma
2Istituto di Istologia ed Embriologia, Università Cattolica del Sacro Cuore, Roma


Citation: Zoppis S, D’Alessio A, Rosini M, Vecchiotti C. DNA quantification by real time PCR and short tandem repeats (STRs) amplification results. Prevent Res 2012; 2 (4): 342-351. Available from: http://www.preventionandresearch.com/. doi: 10.7362/2240-2594.082.2012


doi: 10.7362/2240-2594.082.2012


Parole chiave: Quantificazione, Real Time PCR (qPCR), Short Tandem Repeats (STRs)

Abstract   [Indice]

In ambito genetico-forense, lo scenario ideale è senza dubbio quello rappresentato dall’ottenimento -a partire da un determinato campione di DNA- di un profilo completo, bilanciato e di alta qualità; tuttavia, la realtà della pratica di laboratorio si scontra nella maggior parte dei casi con campioni difficili contenenti DNA di scarsa quantità e/o qualità.
La determinazione della quantità di DNA presente in un campione forense é fondamentale per la maggior parte delle analisi basate sulla PCR perché, se da un lato una quantità eccessiva di templato può provocare la comparsa di picchi aggiuntivi o fuori scala per la tecnica di misurazione, dall’altro, una scarsa quantità può determinare la comparsa di fenomeni stocastici che inficiano la reazione di PCR nonché la successiva interpretazione dei risultati della tipizzazione.
Nella comune pratica di laboratorio genetico-forense i risultati di quantificazione forniti dalla Real Time PCR (qPCR) assumono il ruolo di “linea di confine” tra la possibilità per un determinato campione di DNA di essere sottoposto o meno alle fasi analitiche successive, sulla base di una quantità di DNA compresa nell’intervallo ottimale indicato dal manuale d’uso dello specifico kit utilizzato. Tuttavia, alcuni studi hanno dimostrato che è possibile ottenere dei risultati di tipizzazione anche in presenza di una concentrazione di DNA molto bassa o, paradossalmente, pari a zero (1). Indipendentemente dalla quantità di DNA utilizzata per la quantificazione del campione in esame, software specifici spesso sfruttano la curva standard per calcolare valori di concentrazione che cadono al di sotto del limite di sensibilità del kit utilizzato. Di conseguenza, molti laboratori si trovano a dover affrontare la decisione critica di interrompere le analisi rinunciando alla possibilità di ottenere un profilo genetico seppur parziale, oppure tentare l’amplificazione dell’estratto con la consapevolezza dei rischi interpretativi che ne conseguono.
Nel presente lavoro vengono illustrati i risultati della quantificazione mediante qPCR eseguita in numerose campionature da reperti di interesse forense, sottoposte ad estrazione del DNA mediante resina magnetica. Successivamente alla fase quantificativa, gli estratti di DNA venivano sottoposti ad amplificazione e tipizzazione degli STRs mediante kit di ultima generazione, includendo i campioni risultati negativi alla quantificazione, al fine di verificare se sussista correlazione tra la quantità di DNA rilevata mediante qPCR e la possibilità di ottenere un profilo genetico utile a fini identificativi.
Dai risultati del nostro studio, condotto su 558 campionature da reperti di interesse forense, è stata evidenziata una correlazione tra la quantità di DNA rilevata mediante qPCR e la possibilità di ottenere un profilo genetico utile a fini identificativi.
Nonostante la crescente sensibilità dei kit commerciali di ultima generazione per l’analisi STR, dimostrata dalla capacità di evidenziare picchi allelici -e quindi fornire profili genetici parziali- anche con minime quantità di DNA (a concentrazione inferiore alla soglia minima di sensibilità indicata dal kit di quantificazione utilizzato, addirittura pari a 0 o “Undetermined”), la metodica di qPCR si conferma essere ad oggi un utile e valido strumento di valutazione quali-quantitativa dei campioni genetici.

Introduzione   [Indice]

In ambito genetico-forense, lo scenario ideale è senza dubbio quello rappresentato dall’ottenimento -a partire da un determinato campione di DNA- di un profilo completo, bilanciato e di alta qualità; tuttavia, la realtà della pratica di laboratorio si scontra nella maggior parte dei casi con campioni difficili contenenti DNA di scarsa quantità e/o qualità.
La determinazione della quantità di DNA presente in un campione forense é fondamentale per la maggior parte delle analisi basate sulla PCR perché, se da un lato una quantità eccessiva di templato può provocare la comparsa di picchi aggiuntivi o fuori scala per la tecnica di misurazione, dall’altro, una scarsa quantità può determinare la comparsa di fenomeni stocastici che inficiano la reazione di PCR nonché la successiva interpretazione dei risultati della tipizzazione.
Nella comune pratica di laboratorio genetico-forense i risultati di quantificazione forniti dalla Real Time PCR (qPCR) assumono il ruolo di “linea di confine” tra la possibilità per un determinato campione di DNA di essere sottoposto o meno alle fasi analitiche successive, sulla base di una quantità di DNA compresa nell’intervallo ottimale indicato dal manuale d’uso dello specifico kit utilizzato. Alcuni recenti studi hanno, tuttavia, dimostrato che è possibile ottenere dei risultati di tipizzazione anche in presenza di una concentrazione di DNA molto bassa o, paradossalmente, pari a zero (1). Infatti, indipendentemente dalla quantità di DNA utilizzata per la quantificazione del campione in esame, software specifici spesso sfruttano la curva standard per calcolare valori di concentrazione che cadono al di sotto del limite di sensibilità del kit utilizzato. Di conseguenza, molti laboratori si trovano a dover affrontare la decisione critica di interrompere le analisi rinunciando alla possibilità di ottenere un profilo genetico seppur parziale, oppure tentare l’amplificazione dell’estratto con la consapevolezza dei rischi interpretativi che ne conseguono.
Nel presente lavoro vengono confrontati i risultati della quantificazione mediante qPCR eseguita in numerose campionature da reperti di interesse forense con i relativi profili di tipizzazione degli Short Tandem Repeats (STRs), al fine di verificare se sussista correlazione tra la quantità di DNA rilevata mediante qPCR e la possibilità di ottenere un profilo genetico utile a fini identificativi.  

Materiali e metodi   [Indice]

Le indagini sono state condotte su due reperti di interesse giudiziario consistenti in:
-una sciarpa in lana della lunghezza di circa m 2.00;
-un foulard in cotone di colore blu delle dimensioni di cm 84 x 54.
 
-Analisi di laboratorio
Dopo l’ispezione dei reperti ed i rilievi fotografici degli stessi si è proceduto alle analisi di laboratorio come di seguito riportate.
Le campionature sono state indicate con numerazione progressiva 1-509 per quanto riguarda la sciarpa, e 510-558 per il foulard.
Su ogni singolo prelievo si è proceduto all’esecuzione del test per la diagnosi generica di sangue.
L’esame è stato condotto mediante strisce reattive impregnate di dimetil-diidro-perossiesano e di un indicatore colorimetrico (tetrametilbenzidina,) che, in presenza di emoglobina, assumono una colorazione verde-blu (“Combur Test® ERoche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germania).
Sui campioni risultati positivi al Combur Test® E” è stato eseguito il test per la diagnosi di specie impiegando il Kit Hexagon OBTI (Human- Diagnostics Worldwide, Wiesbaden, Germany).
Si tratta di un test immunocromatografico che utilizza anticorpi monoclonali che formano un complesso “sandwich” con l’emoglobina umana (hHB), se presente nel campione in esame. Questo complesso si evidenzia come una linea blu sulla membrana così da permettere un’interpretazione visiva del risultato.
I risultati delle suddette indagini sono illustrati nella Tabella 1.


Tab. 1 - Risultati delle indagini di laboratorio per la diagnosi generica di sangue (Combur Test® E) e per la diagnosi di specie umana (Hexagon OBTI)
 
 Reperto Num. di campioni positivi per
la diagnosi generica di sangue
Num. di campioni positivi  
per la diagnosi di specie umana
 Sciarpa     429        429
 Foulard      42        42
 
  
-Analisi citologiche
Su frammenti di ogni singola campionatura (N° 1-558) si procedeva ad ulteriori indagini di laboratorio per l’individuazione di elementi cellulari eventualmente presenti.
La ricerca degli elementi cellulari è stata effettuata mediante la tecnica di citocentrifugazione per mezzo dell'apparecchiatura Cytospin 3 (Shandon) che impiega la forza centrifuga per isolare e preparare un monostrato cellulare su appositi vetrini e, allo stesso tempo, è in grado di preservare l'integrità cellulare. Ogni campione è stato lavato mediante ripetute pipettature in un volume di 90 μl di tampone di estrazione. L'intero volume e' stato quindi caricato su porta campioni ad imbuto monouso, sterile, da citocentrifuga e sottoposto a sedimentazione utilizzando i seguenti parametri: tempo 5’, velocità 800 rpm. L'intera operazione e' stata condotta a temperatura ambiente.
Dopo la citocentrifugazione, al fine di evidenziare la presenza di eventuali elementi cellulari, ogni campione e' stato sottoposto a colorazione con ematossilina (Hematoxylin, Vector Laboratories, CA. Cat. H-3401), colorante basico generalmente utilizzato per mettere in risalto strutture cellulari acide come il reticolo endoplasmatico e gli acidi nucleici contenuti nel nucleo cellulare. Le strutture colorate con ematossilina risultano di colore blu.
L'eccesso di colorante e' stato rimosso con acqua e ogni campione è stato analizzato al microscopio ottico con un ingrandimento 20X. A questo scopo e' stato utilizzato un microscopio ZEISS Axioskop 2 plus ed i vetrini sono stati fotografati singolarmente.
Non è stata rilevate la presenza di elementi cellulari in alcuna delle campionature eseguite.
 
-Estrazione del DNA
Frammenti di ogni singolo campione sono stati asportati mediante forbicine e pinzette sterili, inseriti, singolarmente, all’interno di provette da 1,5 mL (sul tappo delle quali è stata apposta la lettera corrispondente al relativo campione) e quindi sottoposti alla procedura di estrazione del DNA mediante il kit commerciale denominato DNA IQ™ System (Promega Corporation, Madison, WI, USA), progettato specificamente per i laboratori di genetica forense, il quale consente l’isolamento del DNA per mezzo di particelle paramagnetiche e può essere usato per l’estrazione di DNA da una grande varietà di campioni, incluse tracce essiccate e liquidi biologici (2).
Per l’estrazione del DNA dai suddetti campioni è stato seguito il protocollo indicato nel manuale d’uso del kit di seguito riportato:
1.prelievo del campione e inserimento all’interno di una provetta da 1,5 mL;
2.aggiunta all’interno di ogni singola provetta di 250 μL di Lysis Buffer (preliminarmente preparato tramite l’aggiunta di 1 μL di DTT 1M per ogni 100 μL di Lysis Buffer) ed incubazione a 70°C per 30’;
3.trasferimento del Lysis Buffer e del campione all’interno di una nuova provetta da 1,5 mL dotata di cestello per centrifuga e successiva centrifugazione alla massima velocità (13000 rpm) per 2’;
4.rimozione del cestello; aggiunta di 7 μL di resina magnetica; vortex ed incubazione a temperatura ambiente per 5’;
5.vortex e posizionamento della provetta sul supporto magnetico; rimozione della soluzione;
6.lavaggio con 100 μL di Lysis Buffer (sol. di lavoro);
7.lavaggio con 100 μL di Wash Buffer 1X (preliminarmente preparato tramite l’aggiunta di 15 ml di etanolo assoluto e 15 ml di isopropanolo al Wash Buffer 2X fornito dal kit), ripetuto per un totale di 3 lavaggi;
8.rimozione accurata della soluzione; asciugatura con tappo aperto, sul supporto magnetico, a temperatura ambiente, per 5’-10’;
9.aggiunta di 30 µL di Elution Buffer ed incubazione a 65°C per 5’;
10.vortex e riposizionamento della provetta sul supporto magnetico;
11.trasferimento della soluzione in una provetta nuova;
12.conservazione dell’estratto a +4°C fino al momento delle analisi.
 
-Quantificazione del DNA per tecnica PCR quantitativa o "Real Time PCR"
Per la quantificazione degli estratti di DNA e' stata utilizzata la tecnica di PCR quantitativa o "Real Time PCR" avvalendosi del sistema Applied Biosystems 7500 Real Time PCR.
Per l'analisi dei campioni di DNA e' stato utilizzato il kit "Quantifiler® Duo DNA Quantification Kit" (Applied Biosystems (Foster City, CA, USA), che permette di identificare simultaneamente la quantità totale di DNA umano e umano maschile in un campione. I risultati ottenuti mediante l'uso di tale kit permettono di valutare se l’estratto contiene quantità sufficienti per procedere con l'analisi STR (Short Tandem Repeat), e può essere utilizzato per determinare la quantità relativa di DNA maschile e femminile presenti nel campione in esame. Infine, il kit utilizzato in questa analisi contiene uno specifico controllo interno (IPC) che permette di valutare la presenza di eventuali inibitori in grado di compromettere l'esito della PCR stessa. L'IPC si basa sull'impiego di una sequenza di DNA sintetica non presente in natura. I geni analizzati sono i seguenti: Ribonucleasi P RNA Component H1 (RPPH1), e il gene SRY, rispettivamente utilizzati per amplificare DNA umano e umano maschile.
 
-Preparazione dei campioni per Real Time PCR
Per ogni campione di DNA e per ogni punto della curva standard è stata preparata una miscela di reazione secondo lo schema illustrato nella Tabella 2.
 

Tab. 2 - Miscela di reazione per la preparazione dei singoli campioni da sottoporre ad analisi Real-Time PCR
 
Componente
(fornito con il kit)
Quantita' in microlitri (µl)
Quantifiler Duo Primer Mix 10.5
Quantifiler Duo PCR Reaction Mix 12.5
Totale 23.00
 
 
 
Le quantità necessarie di componenti sono state preparate in appositi tubi di polipropilene sterili e 23 µl di reazione sono stati dispensati in ogni pozzetto di una piastra da 96 per Real Time (MicroAmp Optical 96-well reaction plate, Part number N801-0560, Applied Biosystems). Successivamente 2 μl di DNA standard, 2 μl di DNA da analizzare e 2 μl di controllo (NTC) sono stati aggiunti ad ogni pozzetto per ottenere un volume finale di reazione di 25 μl/campione.
Prima di essere processate le piastre sono state centrifugate a 300 rpm per circa 30 secondi al fine di rimuovere eventuali bolle d'aria nei pozzetti.
I parametri relativi alla PCR sono illustrati nella Figura 1:
 

Fig. 1

 
-Curva standard
La curva standard e' stata costruita mediante 8 concentrazioni note di DNA (fornito con il kit). Le concentrazioni usate vanno da 50 ng/ml (punto 1) fino a 0,023 ng/ml (punto 8). E' stato utilizzato un duplicato per ogni punto di standard (Figura 2).
 

Fig. 2
 
 
 
 -Analisi dei singoli estratti di DNA (campioni 1-558)
I singoli campioni sono stati esaminati in duplicato. Dall'analisi condotta sul controllo interno (IPC) non si evidenziano elementi che possono far pensare ad una inibizione della reazione di PCR. Infatti, il valore di Ct relativo all'IPC risulta sempre compreso nell'intervallo tra 28-31, in linea con quanto atteso. In altre parole, dall'analisi effettuata si può escludere la presenza di inibitori della reazione di PCR in grado di compromettere l'amplificazione del DNA nei singoli campioni analizzati.
 
-Amplificazione e Tipizzazione degli STRs
Per l’amplificazione del DNA sono stati utilizzati i seguenti kit commerciali: AmpFlSTR®NGM SElect PCR Amplification kit (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA); PowerPlex®ESI 17 System e PowerPlex®ESX 17 System (Promega, Madison, WI, USA).
Il protocollo di amplificazione del DNA relativo ad ogni singolo kit utilizzato viene riportato di seguito, indicando i volumi di reazione per campione. I protocolli di amplificazione utilizzati sono quelli indicati dal rispettivo manuale d’uso di ogni specifico kit. Lo strumento utilizzato é il DNA Thermal Cycler GeneAmp PCR System 2720 (Applied Biosystems).

AmpFlSTR®NGM SElect PCR Amplification kit
-10 μl di AmpFlSTR® NGM SElect Master Mix;
-5 μl di AmpFlSTR® NGM SElect Primer Set;
-10 μl di DNA;
Volume finale della reazione 25 μl
 
PowerPlex®ESI 17 System
-5 μl di PowerPlex® ESI 5X Master Mix;
-2.5 μl di PowerPlex® ESI 17 10X Primer Pair Mix;
-Fino a 17.5 μl di DNA;
Volume finale della reazione 25 μl
 
PowerPlex®ESX 17 System
-5 μl di PowerPlex® ESX 5X Master Mix;
-2.5 μl di PowerPlex® ESX 17 10X Primer Pair Mix;
-Fino a 17.5 μl di DNA;
Volume finale della reazione 25 μl
 
Si è quindi proceduto a preparare i campioni di DNA amplificato per la successiva fase di tipizzazione degli STR autosomici mediante elettroforesi capillare secondo il seguente schema:
Per il kit NGM Select:
-24.5 μl di Hi-Di Formammide;
-0.5 μl di GeneScan 600 LIZ Size Standard;
-1.5 μl di DNA (prodotto di PCR);
Volume finale della reazione 26.5 μl
 
Per i kit ESI 17 ed ESX 17:
-24.5 μl di Hi-Di Formammide;
-0.5 μl di CC5 Internal Lane Standard 500 (ILS 500);
-1.5 μl di DNA (prodotto di PCR);
Volume finale della reazione 26.5 μl
 
Per l’analisi del DNA é stato utilizzato il sequenziatore automatico ABI PRISM 310 Genetic Analyzer (Applied Biosystems).
 
I parametri di impostazione della corsa elettroforetica variano a seconda del kit utilizzato (Tabella 2).
I tracciati elettroforetici così ottenuti sono stati infine analizzati mediante il software GeneMapper ID v3.2.1.

Risultati   [Indice]

I risultati delle analisi genetiche (tipizzazione degli STRs) in relazione alle concentrazioni di DNA rilevate alla qPCR sono i seguenti:
-0 o “Undetermined”: 0% profili completi (n°0 su 77 campioni);
-tra 0 e 0,023 ng/μL: 1.18% profili completi (n°5 su 423 campioni);
-superiori a 0,023 ng/μL: 100% profili completi (n°58 su 58 campioni).

Discussione   [Indice]

Discussione e Conclusioni
La determinazione della quantità di DNA presente in un campione é fondamentale per la maggior parte delle analisi basate sulla PCR perché una quantità eccessiva di templato può provocare la comparsa di picchi aggiuntivi o fuori scala per la tecnica di misurazione, mentre una quantità scarsa di templato può determinare la comparsa di fenomeni stocastici che inficiano la reazione di PCR nonché la successiva interpretazione dei risultati della tipizzazione (3, 4, 5).
Una metodica innovativa relativamente recente nel campo della tipizzazione forense del DNA è la PCR quantitativa (qPCR), nota anche come Real Time PCR.
Questa tecnica prevede l’utilizzo di un’apparecchiatura in grado di misurare la concentrazione del DNA durante le fasi di PCR mentre il templato viene amplificato. La PCR quantitativa comprende le stesse fasi della PCR tradizionale (denaturazione, appaiamento ed estensione); tuttavia un marker fluorescente sensibile alla formazione di dsDNA viene introdotto nella reazione e permette così la misura dell’accumulo dei prodotti di amplificazione.
I vantaggi principali della quantificazione da qPCR comprendono un vasto range dinamico, capacità di alto rendimento, alta sensibilità e quantificazione target-specifica. Ad oggi viene diffusamente utilizzata in ambito forense ed in commercio sono disponibili kit in grado di consentire la valutazione simultanea della quantità di DNA umano totale e di quello maschile tramite una sequenza primer specifica per una determinata regione del cromosoma Y.
La Real Time PCR analizza, ciclo per ciclo, le variazioni nel segnale di fluorescenza proveniente dall’amplificazione di una sequenza bersaglio durante la PCR. Esistono tre diverse fasi che definiscono il processo PCR: 1) amplificazione geometrica o esponenziale, 2) amplificazione lineare 3) fase di plateau.
Il punto migliore per la misura della fluorescenza (tramite il confronto con campioni a concentrazione nota) in rapporto al numero di cicli è la fase esponenziale della PCR nella quale il rapporto tra quantità di prodotto e DNA di partenza è più affidabile. Gli strumenti per qPCR usano la cosiddetta soglia di cicli (Cycle threshold, Ct) per i calcoli. Il valore di Ct è il punto nel quale la fluorescenza del segnale supera un livello di soglia arbitraria; meno cicli occorrono per superare tale soglia e maggiore è la quantità di molecole di DNA templato poste nella reazione.
Mediante tale metodica e' possibile la misurazione del DNA amplificato man mano che la reazione procede, consentendo di determinare la quantità di DNA iniziale presente nel campione in esame in modo molto più accurato e con una sensibilità molto alta. La quantizzazione viene effettuata utilizzando una sonda fluorescente che viene impiegata per ottenere una valutazione della quantità di prodotto di PCR presente ad ogni ciclo della reazione. In pratica, l'intensità di segnale fluorescente misurata durante la fase esponenziale della reazione di PCR consente di determinare la quantità di materiale genetico presente all'inizio della reazione.
Per l'analisi dei campioni di DNA e' stato utilizzato il prodotto “Quantifiler® Duo DNA Quantification Kit” della ditta Applied Biosystems (Foster City, CA, USA). Tale kit permette di identificare simultaneamente la quantità totale di DNA umano e umano maschile in un campione.
I risultati ottenuti mediante l'uso di tale kit permettono di valutare se il campione contiene quantità sufficienti per procedere con l'analisi STR (Short Tandem Repeat), e può essere utilizzato per determinare la quantità relativa di DNA maschile e femminile presenti nel campione in esame.
Il kit utilizzato in questa analisi contiene, inoltre, uno specifico controllo interno (IPC) che permette di valutare la presenza di eventuali inibitori in grado di compromettere l'esito della PCR stessa. L'IPC si basa sull'impiego di una sequenza di DNA sintetica non presente in natura.
La determinazione della quantità di DNA presente in un campione forense é fondamentale per la maggior parte delle analisi basate sulla PCR perché, se da un lato una quantità eccessiva di templato può provocare la comparsa di picchi aggiuntivi o fuori scala per la tecnica di misurazione, dall’altro, una scarsa quantità può determinare la comparsa di fenomeni stocastici che inficiano la reazione di PCR nonché la successiva interpretazione dei risultati della tipizzazione. Alla luce di questo principio emerge l’importanza della possibilità di determinazione di un valore quantitativo minimo in grado di predire il successo dell’analisi STR, consentendo un enorme risparmio agli operatori sia in termini di tempo che economici. Questa possibilità potrebbe, infatti, predire l’insuccesso di un tentativo di amplificare loci STR a partire da un determinato campione di DNA con risultati di quantificazione pari o inferiori al valore minimo, con conseguente assenza di loci STR tipizzabili alla successiva analisi con Elettroforesi Capillare. Tuttavia, è importante sottolineare il rischio di inaccuratezza quantificativa in riferimento a campioni per i quali i valori di quantificazione si posizionano al di sotto della soglia minima indicata dallo specifico kit, per cui lo stesso risultato può non essere riproducibile ad una seconda analisi. Questa evenienza potrebbe, infatti, spiegare sia l’eventuale rilievo sia di un profilo STR completo da un campione “Undetermined” che l’assenza di loci STR da un campione con risultato di quantificazione superiore a 0 ma inferiore alla soglia minima indicata dal kit (1).
Dai risultati del nostro studio, condotto su 558 campionature da reperti di interesse forense, è stata evidenziata una correlazione tra la quantità di DNA rilevata mediante qPCR e la possibilità di ottenere un profilo genetico utile a fini identificativi.
Nonostante la crescente sensibilità dei kit commerciali di ultima generazione per l’analisi STR, dimostrata dalla capacità di evidenziare picchi allelici -e quindi fornire profili genetici parziali- anche con minime quantità di DNA (a concentrazione inferiore alla soglia minima di sensibilità indicata dal kit di quantificazione utilizzato, addirittura pari a 0 o “Undetermined”) (6), la metodica di qPCR si conferma essere ad oggi un utile e valido strumento di valutazione quali-quantitativa dei campioni genetici.
 

Tab. 3 - Parametri di impostazione delle corse elettroforetiche
 
Kit Modulo Inj.secs Run °C Run time
NGM Select GS STR POP 4 (1 ml) G5v2.md5 5 60 28
ESI 17/ESX 17 GS STR POP 4 (1 ml) G5v2.md5 5 60 28
 

Bibliografia   [Indice]

1.Cupples CM, Champagne JR, Lewis KE, Dawson Cruz T. STR Profiles from DNA Samples with “Undetected” or Low QuantifilerResults. J Forensic Sci 2009; 54 (1): 103-107.
2.Vecchiotti C. Estrazione del DNA da substrati complessi mediante resina IQ. Relazione alle VII Giornate Medico-Legali Romane e Europee. Roma: Congresso Annuale SIMLA, 2004.
3.Butler JM. Forensic DNA typing: Biology, Technology and Genetics of STR Markers. Academic Press. San Diego: CA, 2005.
4.Butler JM. Fundamentals of Forensic DNA Typing. San Diego: CA, 2010.
5.Butler JM. Advanced Topics in Forensic DNA Typing: Methodology. Academic Press. San Diego: (CA), 2012.
6.Budowle B, Van Daal A. Extracting evidence from forensic DNA analyses: future molecular biology directions, BioTechniques 2009; 46: 339-350.

Autore di riferimento   [Indice]

Silvia Zoppis
Dipartimento di Scienze Anatomiche, Istologiche, Medico-Legali e dell’Apparato Locomotore, Laboratorio di Genetica Forense, “Sapienza”Università di Roma
e-mail: info@preventionandresearch.com

Download full text:


Galleria fotografica
Fig. 1
Fig. 2